Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Данный текст представляет собой основную информацию для исследователя относительно того, как планировать, оптимизировать и валидировать подобные исследования после того, как будет определена комбинация культуры клеток и цитопатического вируса. Подробная процедура для цитопатического антивирусного анализа приводится в качестве примера подходящего метода наряду с информацией по другим комбинациям вирус-клеточная линия и руководством по адаптированию и валидированию данной процедуры для аналогичных комбинаций.
2. АНТИВИРУСНЫЕ (СНИЖАЮЩИЕ ЦИТОПАТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ) ИССЛЕДОВАНИЯ.
Антивирусные исследования человеческих интерферонов основываются на индукции клеточной реакции в клетках человека, которая предотвращает или снижает цитопатический эффект инфекционного вируса. Сила действия интерферона оценивается путем сравнения его защитного эффекта против вирусного цитопатического эффекта с подобным эффектом соответствующего референтного препарата, калиброванного в Международных единицах.
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ИНТЕРФЕРОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КЛЕТОК Нер2С и ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА
Данное антивирусное исследование интерферонов человека описывает цитопатический эффект редукционного типа. В нем используются клетки человека Hep2c, инфицированные вирусом энцефаломиокардита, для определения эффективности различных экспериментальных препаратов человеческого интерферона. Этот анализ использовался в трех международных исследованиях под эгидой Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) как вариант международных стандартов для человеческого интерферона альфа, человеческого интерферона бета и человеческого интерферона гамма и проявил себя как чувствительный, надежный и воспроизводимый метод для оценок эффективности различных типов человеческого интерферона.
Для культур клеток млекопитающих все процедуры выполняются с использованием стандартных операционных процедур по поддержанию клеточных линий в культуре. Объемы реагентов обозначены для клеточных культур, выполняемых в 75 см2 колбах. Могут использоваться другие типы контейнеров, но при этом необходимо соответствующим образом откорректировать объем.
3.1. ХРАНЕНИЕ И ПОДГОТОВКА КЛЕТОК Hep 2c.
Клетки Hep2c содержатся и пересеваются в культуральной среде А. Клетки хранятся в замороженном виде с использованием стандартных операционных процедур. Растущие клетки могут пересеваться в культуре до 30 пассажей, после чего новую культуру получают из замороженного материала.
В начале исследования из колб берут клетки, образующие 90 % сплошной монослой, используя трипсиновую обработку, описанную ниже.
Из колб удаляют культуральную среду, затем в каждую колбу добавляют 5 мл раствора трипсина, нагретого до 37 C (раствор трипсина содержит 4 мг/мл трипсина Р и 4 мг/мл натрия эделата Р).
Непосредственно перед использованием раствор трипсина разводят 50 объемами фосфатного буфера. Колбу, закрытую пробкой, взбалтывают для промывки клеточного монослоя. Излишки трипсинового раствора убирают.
Колбы выдерживают 5-10 мин при температуре 37 C. Визуально или через микроскоп наблюдают за клетками на предмет появления признаков разделения. При наблюдении в микроскоп видно, как клетки округляются или разделяются и свободно плавают.
Энергично встряхивают колбы для разделения всех клеток, добавляют приблизительно 5 мл культуральной среды А, еще раз встряхивают для получения суспензии отдельных клеток.
При приготовлении суспензии для процедуры анализа необходимо тщательно разделить клетки с помощью пипетки, чтобы разрушить клеточные композиты. Подсчитывают количество клеток и ресуспендируют их в культуральной среде до концентрации 6105 клеток/мл.
3.2. ВОСПРОИЗВЕДЕНИЕ ВИРУСА ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА
Вирус энцефаломиокардита (ЭМКВ) воспроизводится в культуре клеток мышей L-929. Клетки L-929 получают с использованием трипсинизации, как это описывалось для клеток Hep2c (Примечание: при слабом росте клеток может возникнуть необходимость замены неонатальной телячьей сыворотки на эмбриональную коровью сыворотку).
Берут несколько колб со сплошным монослоем культуры клеток L-929. Удаляют среду из колб. Добавляют 2 мл суспензии ЭМКВ, разбавленной в культуральной среде В таким образом, чтобы она содержала приблизительно 2,5108 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на миллилитр. Каждая колба должна содержать 4-6107 L-929 клеток и, таким образом, инфекционность будет составлять 10 БОЕ/клетку. Осторожно взбалтывают вирусную суспензию, распределяя по клеточному монослою, и ставят колбы в термостат приблизительно на один час. Поддерживают pH среды от 7,4 до 7,8.
После адсорбции ЭМКВ, добавляют приблизительно 40 мл культуральной среды в каждую колбу и возвращают колбы в инкубатор с температурой 37°C приблизительно на 30 ч. Поддерживают pH среды от 7,4 до 7,8 с целью получения максимального количества вируса. По окончании инкубации удаляют культуральную жидкость и хранят её при температуре приблизительно 40 C.
Колбы охлаждают до температуры -20 C, чтобы заморозить клеточный монослой. Затем нагревают до комнатной температуры. Добавляют приблизительно 5 мл культуральной среды и встряхивают колбу, чтобы разрушить стенки клеток. Содержимое каждой колбы переносят в контейнер с культуральной жидкостью. Затем культуральную жидкость, содержащую ЭМКВ, переносят в 50 мл пластиковые центрифужные пробирки и центрифугируют при ускорении 500 g
